中藥材及飲片DNA鑒定技術研究及應用

發布日期：2022-07-13 閱讀次數：11231 來源：中國醫藥報

摘要：

中藥材及飲片的準確鑒定是中藥監管的重要問題和環節，是用藥安全的關鍵。2020年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）共收載中藥材及飲片616種，其中多基原藥材占近1/4。受物種延續性、變異性和復雜性等因素的影響，中藥材品種混亂、基原復雜以及同名異物或同物異名等現象普遍存在，給中藥監管帶來很大挑戰。全國市場質量抽檢數據顯示，2013—2020年，我國中藥材及飲片總體合格率分別為64%、68%、75%、77%、84%、88%、91%、96%，表明系列監管措施和現代檢驗科學技術的運用促使中藥材及飲片合格率呈穩步向好趨勢，但混偽品冒充正品或摻偽等問題仍較為突出。2021年國家藥監局組織開展的中藥飲片專項抽檢及中藥材質量監測結果顯示，混偽品代用、摻雜問題依舊存在，如藏柴胡冒充柴胡、關蒼術及雜交蒼術摻偽冒充蒼術、莧菜子摻偽青葙子等提示對這些問題仍須高度關注。

準確可靠的鑒定方法對保障中藥產業健康發展起著舉足輕重的作用。傳統中藥鑒定方法往往依賴中藥形態特征及化學特征，易受多種因素影響，難以從根本上解決鑒別準確性的問題。DNA條形碼技術作為經典鑒定手段的延伸，是利用生物體DNA中一段保守片段，對物種進行快速準確鑒定的新興技術，相比傳統方法具有更好的通用性、重復性和可比性，是現代中藥質量控制和監管中的重要組成部分。

中藥材?DNA條形碼標準數據庫構建

物種差異歸根結底是基因型差異，DNA如“身份證”一樣具有唯一性。DNA條形碼技術利用標準基因片段對物種進行快速、準確識別與鑒定，具有通用性，能夠用來區分不同物種。中藥材DNA條形碼技術的廣泛應用需要存儲海量數據的數據庫作支撐。

在藥用植物DNA條形碼序列篩選中，研究團隊從葉綠體基因組、線粒體基因組和細胞核基因組三個部分進行了篩選和對比，提出將核糖體DNA內轉錄間隔區（ITS）分為3段。其中，長度約為230bp的ITS2序列提取測序較容易，物種鑒定能力更強，更加適合用于對中藥材等存在DNA降解材料的鑒定，且鑒定效率顯著優于國際生物條形碼協會植物工作組推薦的序列組合。研究團隊在國際上首次提出將ITS2序列作為藥用植物標準DNA條形碼，同時建議將ITS2作為新的通用條形碼用于鑒定更廣泛的植物類群，實現了從跟隨國際研究到引領國際研究的華麗轉身。“ITS2作為藥用植物通用DNA條形碼研究”“中草藥DNA條形碼鑒定”等科研論文在一系列國際權威SCI雜志發表后，引發了國際社會對ITS2序列研究的關注。

經過10余年持續研究，研究團隊建立了全球最大的中草藥DNA條形碼鑒定數據庫和藥用植物DNA條形碼鑒定網站（htt p:// www.gpgenome.com/blast）。該數據庫收載了2萬余個物種，除了《中國藥典》收載的藥材及4.8余萬份混偽品樣品外，還涵蓋美國草藥典、日本藥局方、歐洲藥典、韓國藥典和印度藥典收載的絕大多數植物藥。

中藥材DNA條形碼鑒定體系構建及應用

基于ITS2作為中藥通用DNA條形碼序列的研究，研究團隊從中藥材鑒定體系構成、標準操作流程建立、中草藥物種鑒定數據庫平臺建設、鑒定軟件系統開發等多方面，創建了包括以ITS2序列為核心、psbA-trnH為補充序列的植物類藥材DNA條形碼，以及以COI序列為核心、I TS2為輔助序列的動物類藥材DNA條形碼的中藥材DNA條形碼鑒定體系，為中草藥建立了“基因身份證”。實現了利用中草藥“基因身份證”的標準化鑒定，開發了具有中國自主知識產權的中藥高通量DNA條形碼鑒定一體機。同時，該技術體系可實現對中國、美國、日本、歐洲、韓國和印度等國家和地區藥典收載的草藥進行DNA條形碼物種鑒定。2017年3月，在由中國科學報社、人民網等單位共同主辦的“2016中國十大醫學進展/新聞人物”評選活動頒獎典禮上，該成果被評選為“2016 年中國十大醫學進展”。此外，該成果還榮獲2016年度國家科技進步獎二等獎；被世界中醫藥學會聯合會（WFCMS）評價為“標志著中藥進入標準化的基因鑒定時代”；2017年，《自然》雜志專刊評述該體系“開辟了中草藥鑒定新篇章”。

“中藥材DNA條形碼分子鑒定法”作為指導原則已被納入《中國藥典》，鑒定體系也已被國內外眾多檢驗機構、科研院所、高校、藥材生產及流通企業、醫院等應用。大量應用實踐表明，該技術體系從基因層面有效解決了傳統中草藥千百年來物種真偽鑒定的難題，可廣泛用于中藥材源頭加工、生產、流通、研究等各個環節，為中藥材鑒定提供全方位保障，從而服務中藥監管，助力產業品質提升。

基于DNA條形碼標準序列的快速鑒定方法研究及應用

中藥材的生產及流通處于產業鏈前端，是最需要中藥鑒定技術的環節。將中藥DNA條形碼鑒定技術與核酸現場即時檢測技術交叉融合，以適應中藥材現場快速鑒定的不同場景，已成為必要。

研究團隊通過將DNA條形碼技術與等溫DNA擴增技術、側向流檢測試紙（LFD）裝置相結合，成功研發出一種快速鑒定劇毒植物鉤吻的方法。該方法易于執行且不需要專業設備，可在30分鐘內產生可靠結果，適用于鉤吻的現場快速鑒定。

此外，研究團隊創新性地利用多重連接依賴式探針擴增技術、核糖核酸酶H依賴性PCR結合熔解曲線，根據DNA條形碼標準序列中穩定的變異位點，建立了針對蒼術、菟絲子、石菖蒲、人參、黨參、半夏、薄荷、麥冬等近30種中藥材的摻雜鑒定方法，拓寬了DNA條形碼分子鑒定技術的使用范圍。目前已將其應用到國家評價性抽驗非標方法研究及中藥材補充檢驗方法建立研究中，為快速現場鑒定提供了新思路，推動形成涵蓋現場快速檢測的中藥DNA條形碼快速鑒定模式。

由于DNA條形碼技術在物種鑒定方面效果顯著，目前已廣泛應用于植物快速準確鑒定。事實上，針對標準植物DNA條形碼近緣物種分辨率有限的問題，早在2008年加拿大植物無國界（Botany without Borders）會議上，就有學者提出超級條形碼（ultrabarcoding）的概念，認為葉綠體全基因組序列包含的信息量與動物線粒體COI基因序列相當，應該可以將葉綠體基因組的整個序列作為條形碼使用。

近年來，測序技術不斷進步。研究團隊創造性地將“本草基因組學”這一概念和理論引入中藥材鑒定領域，在針對疑難品種的條形碼鑒定研究中，重點采用葉綠體全基因組序列開展物種鑒定。研究團隊建立了中草藥單分子實時DNA測序技術用于葉綠體基因組測序，利用該技術可以快速獲得大量用于“超級條形碼”（super-barcode）鑒定的葉綠體基因組序列。通過多序列比對，研究團隊發現薯蕷屬葉綠體基因組中基因間隔區以及非編碼區變異率高于保守的蛋白編碼區域，LSC區、SSC區變異率大于IR區，并篩選出了10個潛在的適合用于鑒定薯蕷屬植物的特異性DNA條形碼序列，其中包括5個蛋白編碼基因和5個基因間隔區。系統進化樹顯示，葉綠體全基因組序列可作為薯蕷屬物種鑒定的“超級條形碼”，為薯蕷屬系統進化以及物種鑒定等領域研究提供依據。

研究團隊在考察大樣本量不同常用DNA 條形碼序列組合的鑒定能力時發現，常用分子標記對典型多基原藥材大黃的鑒定效率均不足70%。葉綠體基因組作為植物鑒定的“超級條形碼”，在物種鑒定中具有獨特優勢。研究團隊利用高通量測序技術獲得大黃藥材基原物種掌葉大黃、藥用大黃及唐古特大黃的葉綠體基因組，并基于“超級條形碼”開發得到“特異條形碼”，有效解決了大黃藥材基原鑒定問題。同時，該成果在大黃配方顆粒標準研究制定過程中起到積極作用。另外，研究團隊通過采用貝母屬10個物種26個樣本的葉綠體基因組序列，也驗證了“超級條形碼”對近緣物種準確鑒定的有效性。

值得關注的是，受限于應用成本以及數據分析所需服務器設施等因素，“超級條形碼”目前尚不能如 DNA條形碼一樣廣泛推廣。因此，研究團隊為解決DNA條形碼目前難以鑒定近緣物種的困境，針對既定植物類群，在葉綠體基因組測序的基礎上篩選得到“特異條形碼”。該條形碼結合了單位點條形碼鑒定速度快、“超級條形碼”變異位點多的優勢，可有效應用于種及種下分類等級植物鑒定。

隨著現代雜交育種技術的廣泛應用，中藥材雜交品種成為可能。種質是中藥材品質安全、有效和質量可控的物質基礎。不同物種之間雜交產生的雜交品種，雖然性狀等鑒別特征與親本差別微小，但由于化學成分很可能發生了改變，其是否能夠作為中藥材使用、臨床功效是否受到影響等藥品安全有效性問題尚無明確定論，給中藥質量控制和監管帶來很大的考驗。

今年3月，國家藥監局、農業農村部、國家林業和草原局、國家中醫藥管理局聯合發布的《中藥材生產質量管理規范》明確，禁用人工干預產生的多倍體或者單倍體品種、種間雜交品種和轉基因品種。由于種間雜交品種同時具備母本和父本的遺傳特征，短片段的DNA條形碼及細胞器基因組的“超級條形碼”無法滿足針對這類復雜品種的鑒定需求。為保證中藥材種質的純正性，降低不確定種質帶來的風險，建立有效的鑒定方法十分必要。隨著高通量測序技術的發展，大量物種的基因組數據也在不斷公布更新，但對于一些基因組偏大、雜合率較高、重復序列頗多、倍性較復雜的中藥材物種來說，全基因組測序技術成本太高。簡化基因組測序，即利用限制性內切酶打斷基因組DNA，對特定片段進行高通量測序，從而獲得海量遺傳多態性標簽序列，以充分代表目標物種全基因組信息的策略，為我們從全基因組層面解決雜交品種鑒定問題提供了新思路。

中華草龜（習稱烏龜）是中藥材龜甲、龜甲膠的唯一法定來源，市場需求量較大。由于烏龜性成熟期長、生長緩慢，水產養殖成效受到限制，市場上烏龜偽品、混淆品充斥。中華花龜（習稱花龜）生長速度較快，但生態位窄，因此環境適應性較差，其大范圍養殖同樣受到限制。人工培育的父本烏龜與母本花龜的雜交品種——花雜草龜充斥市場，給中藥飲片市場監管帶來很大的挑戰。由于花雜草龜同時保留了親本龜的中間表型特征和基因型，使得傳統性狀鑒別方法以及常用分子鑒別方法均無法對其進行區分。研究團隊利用高通量測序技術，構建了首個烏龜簡化基因組測序文庫以及花龜重測序基因組文庫，獲得高質量SNP標記 88087個，設計了用于雜交品種花雜草龜鑒定的通用引物，開發了“特異條形碼”，并起草了補充檢驗方法，有效解決了針對雜交龜甲充斥市場的監管技術難題。

經過10余年的發展，DNA條形碼技術在中藥鑒定領域的研究和應用更加廣泛和深入。從單序列及其組合，到細胞器基因組的“超級條形碼”，再到基于全基因組遺傳多樣性信息開發的“特異條形碼”，DNA條形碼技術助力中藥材現代鑒定技術研究和應用發展，并成為避免中藥材市場陷入“劣幣驅逐良幣”惡性循環的有效手段。

此外，研究團隊依據多個國家和地區藥典收錄的草藥物種，完成全球藥典草藥基因組數據庫建設并上線。該數據庫依據中國藥典、美國草藥典、日本藥局方、韓國藥典、印度藥典、埃及藥典、歐洲藥典以及巴西藥典等，收錄903個草藥物種的34346條數據，包括867個物種的21872條DNA條形碼數據，674個物種的2000余個細胞器基因組及核基因組數據等。該數據庫是全球首個針對藥典收載草藥物種的大型基因組學數據庫，將為草藥物種鑒定、用藥安全等提供信息支撐。今年1月，該數據庫研究入選了中華中醫藥學會發布的“2021年度中醫藥十大學術進展”。

然而，目前DNA條形碼技術在藥檢系統中的應用還有待深入推廣，相關檢驗業務開展較少，相關標準制修訂和執行仍有待推進。如何使現代中藥鑒定技術廣泛應用于中藥檢定工作，如同理化檢驗、色譜技術等在中藥質量控制及監督檢驗中得到普及一般，是當下需要思考和摸索的問題。研究團隊認為，可以從以下幾個方面入手。一是加快適應中藥日常檢定工作的法定中藥DNA條形碼信息數據庫完善及相關鑒定軟件的開發。二是加強多學科、多技術方法的融合，推動中藥材DNA條形碼技術自動化研發進程。三是推動地方標準、行業標準等標準中針對具體物種的DNA條形碼鑒定研究及相關標準制定工作的開展，推廣中藥材DNA條形碼技術在中藥監管中的應用。

中醫藥產業發展必須依靠科學和技術，只有推動原創性技術的研究應用才能更好地助力中藥材產業發展。未來，中藥材DNA條形碼技術將會越來越多地參與到中藥材質量控制研究中，更好適應時代發展的需要，推動中藥材質量控制水平邁上新臺階。